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北京時間10月4日17時45分許，2017年諾貝爾化學(xué)獎頒給雅克·杜波切特(Jacques Dubochet), 阿希姆·弗蘭克(Joachim Frank)和理查德·亨德森(Richard Henderson)，表彰他們發(fā)展了冷凍電子顯微鏡技術(shù)，以很高的分辨率確定了溶液里的生物分子的結(jié)構(gòu)。

圖片來源：諾貝爾官網(wǎng)。

獲獎人簡介

約阿基姆·弗蘭克（Joachim Frank）德裔生物物理學(xué)家，現(xiàn)為哥倫比亞大學(xué)教授。他因發(fā)明單粒子冷凍電鏡（cryo-electron microscopy）而聞名，此外他對細(xì)菌和真核生物的核糖體結(jié)構(gòu)和功能研究做出重要貢獻(xiàn)。弗蘭克 2006 年入選為美國藝術(shù)與科學(xué)、美國國家科學(xué)院兩院院士。2014 年獲得本杰明·富蘭克林生命科學(xué)獎。

理查德·亨德森（Richard Henderson）蘇格蘭分子生物學(xué)家和生物物理學(xué)家，他是電子顯微鏡領(lǐng)域的開創(chuàng)者之一。1975 年，他與 Nigel Unwin 通過電子顯微鏡研究膜蛋白、細(xì)菌視紫紅質(zhì)，并由此揭示出膜蛋白具有良好的機(jī)構(gòu)，可以發(fā)生α- 螺旋。近年來，亨德森將注意力集中在單粒子電子顯微鏡上，即用冷凍電鏡確定蛋白質(zhì)的原子分辨率模型。

雅克·迪波什（Jacques Dubochet）， 1942 年生于瑞士，1973 年博士畢業(yè)于日內(nèi)瓦大學(xué)和瑞士巴塞爾大學(xué)，瑞士洛桑大學(xué)生物物理學(xué)榮譽(yù)教授。Dubochet 博士領(lǐng)導(dǎo)的小組開發(fā)出真正成熟可用的快速投入冷凍制樣技術(shù)制作不形成冰晶體的玻璃態(tài)冰包埋樣品，隨著冷臺技術(shù)的開發(fā)，冷凍電鏡技術(shù)正式推廣開來。

革命性的冷凍電鏡技術(shù)

細(xì)胞里面的生命活動井然有序，每一個部分都有其特定的結(jié)構(gòu)，承擔(dān)不同的功能。生物大分子則是一切生命活動的最終執(zhí)行者，它們主要是核酸和蛋白。核酸攜帶了生命體的遺傳信息，而蛋白是生命活動的主要執(zhí)行者。自現(xiàn)代分子生物學(xué)誕生以來的半個世紀(jì)里，解析和分析生物大分子的結(jié)構(gòu)、進(jìn)而闡釋其功能機(jī)制一直都是現(xiàn)代生命科學(xué)的核心問題之一。

事實(shí)上，一切自然科學(xué)都涉及物質(zhì)結(jié)構(gòu)及結(jié)構(gòu)間的相互作用為核心的研究方向，天文學(xué)研究宇宙、星體等的結(jié)構(gòu)及其相互作用，粒子物理研究物質(zhì)世界的基本粒子的結(jié)構(gòu)和相互作用，甚至包括應(yīng)用性很強(qiáng)的材料科學(xué)都是以研究新型材料的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)等為核心。結(jié)構(gòu)生物學(xué)研究的直接目的是弄清楚生命大分子結(jié)構(gòu)，從而更好地理解生命，理解這個自然界中“逆熱力學(xué)第二定律”而誕生的奇跡；最終目標(biāo)是公眾通常關(guān)心的實(shí)用價值。

像數(shù)學(xué)物理公式不會直接造出飛機(jī)、導(dǎo)彈、計(jì)算機(jī)一樣，蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)這樣的基礎(chǔ)研究不會直接轉(zhuǎn)化為人們生產(chǎn)生活的必須物品。比較具體的應(yīng)用，如藥物設(shè)計(jì)、疫苗開發(fā)、醫(yī)療診斷和蛋白質(zhì)分子性能改造（如科學(xué)實(shí)驗(yàn)或工業(yè)生產(chǎn)中酶活性穩(wěn)定性優(yōu)化）等是蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)研究比較容易被大眾所理解的一個方向，但卻只是其研究價值的一個側(cè)面而已。

蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)如同生命科學(xué)里的數(shù)學(xué)公式和物理定律，甚至在以后會充當(dāng)生命科學(xué)里面的“化學(xué)元素周期表”，除了幫助發(fā)現(xiàn)或設(shè)計(jì)新藥等，它更重要的價值是作為最基礎(chǔ)最上游的研究之一，通過影響一切與其密切相關(guān)的下游科學(xué)和技術(shù)，從而改變我們的世界。

結(jié)構(gòu)生物學(xué)最早誕生于上個世紀(jì)中葉，它是一門通過研究生物大分子的結(jié)構(gòu)與運(yùn)動來闡明生命現(xiàn)象的學(xué)科，在其發(fā)展史上有兩個里程碑式的事件，一個是DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)的發(fā)現(xiàn)，另一個肌紅蛋白（Myglobin）晶體結(jié)構(gòu)的解析，這兩個事件都是上個世紀(jì)最重要的革命性科學(xué)進(jìn)展，均在劍橋MRC分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室完成，并且都于1962年獲得了諾貝爾獎（一個生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎，一個化學(xué)獎）。同時它們都是最早使用X射線的方法來解析生物大分子結(jié)構(gòu)，而這個方法在過去半個世紀(jì)里，一直占據(jù)結(jié)構(gòu)生物學(xué)的統(tǒng)治地位。

在當(dāng)今結(jié)構(gòu)生物學(xué)研究中普遍使用的冷凍電鏡，是上個世紀(jì)七八十年代開始出現(xiàn)、近兩年飛速發(fā)展的革命性技術(shù)，它可以快速、簡易、高效、高分辨率解析高度復(fù)雜的超大生物分子結(jié)構(gòu)（主要是蛋白質(zhì)和核酸），在很大程度上取代并且大大超越了傳統(tǒng)的X射線晶體學(xué)方法。

冷凍電鏡并不是這兩年才建立的。在蛋白質(zhì)X射線晶體學(xué)誕生大約10多年以后的1968年， 作為里程碑式的電鏡三維重構(gòu)方法，同樣在劍橋MRC分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室誕生，Aron Klug教授因此獲得了1982年的諾貝爾化學(xué)獎。另一些突破性的技術(shù)在上世紀(jì)70年代和80年代中葉誕生，主要是冷凍成像和蛋白快速冷凍技術(shù)。這里面的代表科學(xué)家有Ken Taylor, Robert Glaeser和Jacques Dubochet等。

快速冷凍可以使蛋白質(zhì)和所在的水溶液環(huán)境迅速從溶液態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)椴ＡB(tài)，玻璃態(tài)能使蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)保持其天然結(jié)構(gòu)狀態(tài)，如果以緩慢溫和的方式冷凍，這個過程會形成晶體冰，生物分子的結(jié)構(gòu)將被晶格力徹底損壞。低劑量冷凍成像能夠保存樣品的高分辨率結(jié)構(gòu)信息，確保了從電鏡圖形中解析蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的可能性。與此同時Joachim Frank等則在電鏡圖像處理算法方面奠定和發(fā)展了這項(xiàng)技術(shù)的理論基礎(chǔ)。由此冷凍電鏡的雛形基本建立，總的思路為：

　　1）樣品冷凍（保持蛋白溶液態(tài)結(jié)構(gòu)）；

　　2）冷凍成像（獲取二維投影圖像）；

　　3）三維重構(gòu)（從二維圖像通過計(jì)算得到三維密度圖）。

該方法為生物大分子結(jié)構(gòu)研究提供了一個和X射線晶體學(xué)完全不一樣的、全新的思路。但是由于技術(shù)方法的瓶頸，在此后30多年的時間里只能做一些相對低分辨率的結(jié)構(gòu)解析工作，在分辨率上一直不能和X射線晶體學(xué)比較，甚至一度被嘲笑為”blob-ology“（英文諷刺語，“一坨輪廓的技術(shù)”）。

但對于冷凍電鏡來說，技術(shù)難點(diǎn)遠(yuǎn)非單純冷凍。冷凍成像和圖像處理算法一直都是瓶頸。從冷凍電鏡技術(shù)誕生以來的近30年時間里，其一直都有進(jìn)展，只是相對比較緩慢。

最重要的革命性事件大約發(fā)生在兩三年前：一個是直接電子探測器的發(fā)明，另一個是高分辨率圖像處理算法的改進(jìn)。MRC分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室的兩位科學(xué)家Richard Henderson和Sjors Scheres在這次革命中起了關(guān)鍵作用（作者注：現(xiàn)代科技革命往往是諸多研究機(jī)構(gòu)若干團(tuán)隊(duì)共同參與，此處僅列舉關(guān)鍵代表，并且僅從技術(shù)角度討論，不涉及生物學(xué)應(yīng)用）。

Richard Henderson是探測器方面的先驅(qū)，而Sjors Scheres則因他設(shè)計(jì)的Relion程序而名聲大噪，他們由此當(dāng)選為《自然》雜志2014年“十大科學(xué)進(jìn)展年度人物”。兩位科學(xué)家一個從硬件，一個從軟件將冷凍電鏡技術(shù)推向了巔峰，將冷凍電鏡技術(shù)的分辨率推向了新高度。（作者注: Henderson教授的貢獻(xiàn)遠(yuǎn)非探測器一個方面，包括冷凍電鏡理論基礎(chǔ)、算法、軟件，重要生物大分子應(yīng)用，如曾首次解析視紫紅質(zhì)跨膜螺旋等等方面；早在20多年前，他就通過一系列理論分析，預(yù)言了冷凍電鏡研究的尺度、分辨率極限、技術(shù)瓶頸等等，并且斷言：冷凍電鏡將超越其它一切技術(shù)方法，成為蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)研究的主導(dǎo)工具，如今這些預(yù)言全部應(yīng)驗(yàn)。）

和此前使用的CCD相比，新發(fā)展的直接電子探測器不僅在電鏡圖形質(zhì)量上有了質(zhì)的飛躍，同時在速度上大幅提高，還可以以電影的形式快速記錄電鏡圖像。這些特性同時也伴隨著電鏡圖像處理方面的重大變革，電鏡技術(shù)此前在分辨率上的一個主要瓶頸是電子束擊打生物樣品造成的圖像漂移和輻射損傷。有了快速電影記錄，我們就可以追蹤圖像漂移軌跡而對圖像做運(yùn)動矯正和輻射損傷矯正，大大提高數(shù)據(jù)質(zhì)量。

盡管如此，電鏡圖像處理一直都是一項(xiàng)極具挑戰(zhàn)性的任務(wù)，主要的問題是冷凍電鏡的圖像噪音極高、信號極低，而我們的目標(biāo)是從中提取近原子分辨率的結(jié)構(gòu)信息，這就像在一個機(jī)器轟鳴的工廠里監(jiān)測一只螞蟻爬行的聲音。冷凍電鏡科學(xué)家就是要完成這項(xiàng)艱巨的任務(wù)，并且真的做到了。有了硬件和軟件方面的雙重提高，冷凍電鏡的分辨率目前已得到了極大的提高，可以和晶體學(xué)相媲美；并且在其它方面已經(jīng)大大超越了晶體學(xué)。

主要體現(xiàn)在下面幾個方面：

第一，不需要結(jié)晶，研究對象范圍大大擴(kuò)展，研究速度大大提高。對于小分子，比方說無機(jī)鹽礦物質(zhì)等自發(fā)就能長出晶體，小而且穩(wěn)定的蛋白質(zhì)目前來說結(jié)晶并不困難，但是這類意義重大的蛋白幾乎都已經(jīng)解析完了，在科學(xué)上沒有任何重大意義；當(dāng)今時代，小蛋白已經(jīng)完全不能滿足科學(xué)家們強(qiáng)烈的探索欲望，結(jié)構(gòu)生物學(xué)研究的對象越來越大，體系越來越復(fù)雜，結(jié)晶幾乎成為不可能的事情，即使能結(jié)晶，也不一定衍射，有衍射也不一定能得到原子分辨率結(jié)構(gòu)。

很多年前，許多蛋白質(zhì)晶體科學(xué)家為了完成一項(xiàng)艱巨的任務(wù)，一個課題少則5到10年，多則20年，核糖體從上世紀(jì)80年代初首次長出晶體到2000年左右最終拿到原子分辨率結(jié)構(gòu)整整經(jīng)歷了20年；線粒體呼吸鏈復(fù)合物I從上世紀(jì)90年代初研究，第一次報(bào)道完整晶體結(jié)構(gòu)大約是20年以后。

而冷凍電鏡方法跳過超大分子復(fù)合物結(jié)晶難的這層技術(shù)屏障，以直接解析復(fù)合物的溶液狀態(tài)的結(jié)構(gòu)為目標(biāo)。

現(xiàn)在利用這項(xiàng)技術(shù)，在MRC-LMB一周時間就可以解析一個新的核糖體結(jié)構(gòu)；英國皇家學(xué)會主席、MRC-LMB結(jié)構(gòu)中心主任Venki Ramakrishnan 教授，因?yàn)楹颂求w的晶體結(jié)構(gòu)研究而獲得2009年諾貝爾化學(xué)獎。他的實(shí)驗(yàn)室在2014年發(fā)表了最后一篇晶體結(jié)構(gòu)文章，此后的文章全部以冷凍電鏡為主。哥倫比亞大學(xué)有一個非常執(zhí)著的博士后，研究蘭尼堿受體（Ryanodine Receptor）晶體結(jié)構(gòu)長達(dá)十年之久，最后放棄了晶體，轉(zhuǎn)向了冷凍電鏡技術(shù)，同時與清華大學(xué)教授顏寧和LMB的Scheres研究組合作，幾個月就解決了這個難題，并且達(dá)到近原子分辨率。

第二，樣品需求量小，樣品制備快，可重復(fù)性高。重要生物樣品都是非常珍貴的，總體來說是以微克或者最多以毫克來計(jì)量，即使得到這點(diǎn)樣品，也要花費(fèi)生物學(xué)家?guī)字堋讉€月甚至更長的時間（大多數(shù)時候都需要摸索各種條件使樣品處于相對穩(wěn)定的狀態(tài)，以便做進(jìn)一步結(jié)構(gòu)研究）。

蛋白質(zhì)晶體一般要求高濃度大體積，沒有量變就沒有質(zhì)變。而同樣量的蛋白可以稀釋以后制備若干冷凍電鏡樣品，每個樣品有成百上千的區(qū)域，每個區(qū)域有幾百個小孔，每一個小孔甚至可以收集多張照片。解析一般蛋白的原子結(jié)構(gòu)需要幾萬個顆粒，而對于高對稱性的樣品幾千個顆粒就足夠。

第三，可以研究天然的、動態(tài)的結(jié)構(gòu)。X射線晶體學(xué)研究生物大分子結(jié)構(gòu)的一個主要弱點(diǎn)是無法拿到天然的動態(tài)的結(jié)構(gòu)，這是因?yàn)檠芯咳藛T無論如何也無法繞開結(jié)晶這個過程。冷凍電鏡就是要做這件事情：直接解析天然的、溶液態(tài)的、動態(tài)的（dynamic），甚至原位(in situ)的結(jié)構(gòu)，從而理解生命分子如何在空間和時間兩個尺度上以活的動態(tài)的方式發(fā)揮功能。

晶體學(xué)只能嘗試不同的條件獲得生物大分子某個或者某些固定的狀態(tài)，而且容易出現(xiàn)晶體堆積引起的不真實(shí)相互作用方式。形象地說，冷凍電鏡可以制作完整的高清電影，晶體學(xué)只能從電影里截屏。

第四，技術(shù)革命還將開啟巨大的潛在醫(yī)療價值。冷凍電鏡技術(shù)方法在時間和精度方面的大幅度提高有時會導(dǎo)致不可預(yù)測的重大科學(xué)和應(yīng)用價值。比如，活體病毒結(jié)構(gòu)分析如果可以在分鐘級別完成，這將有可能轉(zhuǎn)化為潛在的醫(yī)療檢測手段：從病人體內(nèi)抽取血樣或感染組織細(xì)胞，幾分鐘以后，非常清晰明了地展現(xiàn)病人在細(xì)胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)層面的異常狀況，甚至給出局部的原子結(jié)構(gòu)圖，從而給出精準(zhǔn)的治療方案。這個想法現(xiàn)在可能聽起來有點(diǎn)像笑話，或許再過若干年人們就不這樣認(rèn)為了。

當(dāng)然冷凍電鏡的革命性不僅僅體現(xiàn)在上述四方面，在此就不一一列舉。有關(guān)冷凍電鏡更加詳細(xì)的介紹，可參見筆者等2010年的中文綜述（《生物物理學(xué)報(bào)》，2010年7月，第26卷，第7期: 533-559）。文章中對未來幾年的發(fā)展趨勢所做的展望，如直接電子探測器的普及、非對稱性蛋白復(fù)合物近原子分辨率結(jié)構(gòu)解析、冷凍電鏡相關(guān)計(jì)算性能的大規(guī)模提升等等，目前絕大多數(shù)都在過去的兩三年內(nèi)得以實(shí)現(xiàn)并飛速發(fā)展。

Frank 師從德國著名的電子顯微學(xué)家Hoppe博士，Hoppe學(xué)派主張對任意形狀樣品直接三維重構(gòu)，后來的電子斷層三維重構(gòu)及cryoEM三維重構(gòu)技術(shù)都與他的早期思想有關(guān)。Frank博士提出基于各個分散的全同顆粒（蛋白）的二維投影照片，經(jīng)過分類對位平均，然后三維重構(gòu)獲得蛋白的三維結(jié)構(gòu)，發(fā)展了一系列算法并編寫軟件（SPIDER）實(shí)現(xiàn)無需結(jié)晶的蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)解析技術(shù)。尤其在核糖體三維重構(gòu)方面有一系列的重要開創(chuàng)性工作，可惜當(dāng)年核糖體結(jié)構(gòu)諾貝爾獎沒有給他。現(xiàn)在給他在cryoEM單顆粒三維重構(gòu)的一個諾貝爾獎，實(shí)至名歸。